Oggi parliamo del problema che ha causato all'esperimento di innumerevoli colleghi di ricerca - Western Blot (WB). Questo esperimento apparentemente semplice ma pieno di "trappole", perché ci fa sempre inciampare ancora e ancora? Ora esaminiamo i motivi di fallimenti insieme.
I. Nessuna banda
Possibili ragioni possono includere:
- Problemi di anticorpi: l'anticorpo può essere inefficace, non specifico o non legarsi alla proteina bersaglio.
- Problemi del campione: il campione può contenere sostanze interferenti, essere troppo bassa di concentrazione o essere già degradato.
- Problemi di elettroforesi: condizioni di elettroforesi inappropriata, come tensione, tempo o uso improprio del tampone.
- Problemi di trasferimento: problemi durante il processo di trasferimento, come selezione inappropriata della membrana, tempo di trasferimento o buffer di trasferimento.
- Problemi di blocco: la soluzione di blocco può essere inappropriata o il tempo di blocco potrebbe essere troppo lungo.
- Problemi di colorazione: il reagente di colorazione può essere scaduto, insensibile o usato in modo improprio.
Problemi di attrezzatura: l'attrezzatura può non funzionare o non essere correttamente calibrata.
- Problemi di funzionamento sperimentale: l'operazione sperimentale potrebbe non essere standardizzata, come lavaggio insufficiente o carico di campioni irregolare.
- Problemi di modifica delle proteine: la proteina target può essere sottoposta a modifiche post-traduzionali che prevengono il riconoscimento degli anticorpi.
- Problemi di espressione della proteina target: la proteina target può avere un'espressione molto bassa o nessuna espressione nelle cellule o nei tessuti rilevati.
Ii. Sfondo elevato
Possibili ragioni possono includere:
- Elevata concentrazione di anticorpi: l'uso di troppo anticorpo può aumentare il legame non specifico, con conseguente background elevato.
- Problemi di qualità degli anticorpi: l'anticorpo può avere un elevato legame non specifico o react incrociata con altre proteine.
- Blocco insufficiente: la soluzione di blocco non riesce a coprire efficacemente i siti di legame non specifici sulla membrana, con conseguente sfondo elevato.
- Problemi di membrana: la membrana può avere una scarsa qualità o una contaminazione, portando a background elevato.
- Trasferimento incompleto: durante il processo di trasferimento, le proteine non possono essere completamente trasferite sulla membrana, con conseguente background elevato.
- Lavaggio insufficiente: le fasi di lavaggio non riescono a rimuovere efficacemente l'anticorpo non legato o altre impurità, portando a un background elevato.
- Problemi di reagente di colorazione: il reagente di colorazione può essere troppo sensibile o instabile, con conseguente background elevato.
- Problemi di attrezzatura sperimentale: l'attrezzatura può avere perdite o interferenze, portando a background elevato.
- Problemi del campione di proteine: il campione può contenere una grande quantità di sostanze interferenti, come prodotti di degradazione delle proteine o altre impurità.
- Problemi di funzionamento sperimentale: l'operazione sperimentale potrebbe non essere standardizzata, come il tempo di incubazione prolungato o l'alta temperatura.
Iii. Bande non specifiche o dimensioni di bande proteiche errate
Possibili ragioni possono includere:
- Troppi passaggi di cellule, con conseguenti diversi livelli di espressione proteica, portando a dimensioni incoerenti della banda o alla presenza di più bande.
- Degradazione del campione proteico, con conseguente minore peso molecolare proteico o presenza di più bande.
- In vivo i campioni di proteine espressi possono avere varie forme di modifiche come acetilazione, metilazione, alchilazione, fosforilazione e glicosilazione, che portano a dimensioni incoerenti della banda o alla presenza di più bande.
- La proteina target contiene più isoforme o varianti di giunzione, con conseguenti dimensioni incoerenti della banda o la presenza di più bande.
